Actividad in vitro contra Leishmania y permeación en piel humana de liposomas ultradeformables de miltefosina / In vitro activity against Leishmania and human skin permeation of miltefosine ultradeformable liposomes

Introducción: los liposomas ultradeformables de miltefosina (LUD-MIL) constituyen una opción para el tratamiento tópico en leishmaniasis cutánea penetrando los estratos de la piel hasta la dermis, sitio donde habita el parásito. Objetivo: diseñar LUD-MIL y determinar su actividad contra L. (Viannia) panamensis y L. (V.) braziliensis y la permeación en piel humana. Métodos: los LUD-MIL, liposomas convencionales de fosfatidilcolina (LConv) y LUD-MIL-fluorescente (LUD-MIL-Fluo) fueron preparados por el método de rehidratación de película lipídica. Se caracterizaron fisicoquímicamente y se determinaron: la liberación en membrana semisintéticas, la retención en las capas de la piel y la permeación en piel humana. La citotoxicidad en THP-1 fue determinada por el ensayo colorimétrico de MTT y la actividad en promastigotes y amastigotes intracelulares por recuento microscópico. Resultados: el tamaño, índice de polidispersión, potencial Z y concentración de fosfolípidos de los LUD-MIL fue de 100,7 nm, 0,147, -12,0 mV y 53,24 mM respectivamente. El flujo de MIL a través de la membrana fue mayor con LUD-MIL que con MIL-libre. El tratamiento con LUD-MIL indujo menor acumulación de la MIL en el estrato corneo y mayor permeación que el tratamiento con MIL libre. Los LUD-MIL y los LConv-MIL mantuvieron la actividad de la MIL en los parásitos y células. Los LUD-MIL fueron más tóxicos para las células que los LConv y la MIL y más activos en amastigotes intracelulares de L. (V.) braziliensis. Conclusión: los LUD-MIL preparados conservaron la actividad anti-Leishmania de la MIL y permitieron la liberación del compuesto en membranas y piel humana. Ensayos en modelos experimentales de leishmaniasis cutánea para evaluar la actividad de estas formulaciones son urgentes de realizar(AU)

Introduction: miltefosine ultradeformable liposomes (MIL-LUD) are an option for the topical treatment of cutaneous leishmaniasis penetrating the skin layers to the dermis where the parasite inhabits. Objective: to design MIL-LUD and determine their in vitro activity against L. (Viannia) panamensis and L. (V.) braziliensis and to determine human skin permeation. Methods: MIL-LUD, phosphatidylcholine liposomes (MIL-LConv) and fluorescent MIL-LUD (MIL-LUD-Fluo) were prepared by lipid film rehydration method. They were physicochemically characterized to determine drug release in semisynthetic membrane, retention in skin layers and permeation on human skin membranes. Cytotoxicity in THP-1 was determined by the MTT colorimetric test and activity in promastigotes and intracellular amastigotes by microscopic counting. Results: the size, the polydispersion index, the Zeta potential and phospholipid content were 100.7 nm, 0.147, -12.0mV and 53.24mM, respectively for MIL-LUD. MIL flow through the semisynthetic membrane was greater with MIL-LUD than MIL-free treatment. MIL-LUD treatment induced lower MIL accumulation in the stratum corneum and increased permeation than MIL free treatment. The MIL-LUD and MIL-Conv maintained MIL activity in parasites and cells. The MIL-LUD was more toxic to cells than MIL-Conv and more active against intracellular amastigotes of L. (V.) braziliensis. Conclusion: prepared LUD -MIL retained the anti-leishmanial activity of the MIL and allowed the compound release in human skin and membranes. Testing of experimental cutaneous leishmaniasis models to evaluate the activity of these formulations are urgently needed(AU)

Cell accumulation and antileishmanial effect of exogenous and endogenous protoporphyrin IX after photodynamic treatment / Acumulación celular y efecto anti- Leishmania de la protoporfirina IX exógena y endógena después del tratamiento fotodinámico

Introduction: Photodynamic therapy (PDT) using 5-aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX (ALA-PpIX) constitutes an interesting alternative for cutaneous leishmaniasis treatment. Objective: To evaluate the production of PpIXbased on the administration of ALA and MAL and the effect of ALA-PDTat cellular level on non-infected and infected THP-1 cells using Leishmania ( Viannia ) panamensis or Leishmania ( Leishmania ) infantum (syn Leishmania chagasi ) parasites. Materials and methods: Protoporphyrin IX (PpIX) production and mitochondrial colocalization were evaluated by confocal microscopy. Cell toxicities were evaluated after treatment with the compounds, followed by light irradiation (597-752 nm) at 2.5 J/cm 2 fluency using a colorimetric MTT assay for THP-1 cells and a standard microscopic analysis of parasites. Results were expressed as compound concentration activity against 50% of cells or parasites (CC 50 or IC 50 ). Results: ALA or MAL induced an endogenous PpIX with a red fluorescence localized mainly in the mitochondria inside human cells. ALA and MAL-PDT induced a similar range of toxicities on THP-1 cells (CC 50 0.16±0.01mM and 0.33±0.019 mM, respectively) without any apparent inhibition of intracellular parasites in the infected cells as compared to untreated controls. Exogenous PpIX-PDT was toxic to THP-1 cells (CC 50 0.00032±0.00002 mM), L. (L.) infantum (IC 50 0.003±0.0001 mM) and L. (V.) panamensis (IC 50 0.024±0.0001 mM) promastigotes. Conclusions: Despite the effectiveness of exogenous PpIX on promastigotes and the production of PpIX by human infected cells, treatment with ALA or MAL before irradiation was unable to completely destroy L. (L.) infantum or L. (V.) panamensis intracellular amastigotes.

Introducción. El tratamiento fotodinámico con ácido 5-aminolevulínico como inductor de la protoporfirina IX (ALA-PpIX) constituye una alternativa interesante en el tratamiento de la leishmaniasis cutánea. Objetivo. Evaluar la producción de protoporfirina IX (PpIX) a partir de la administración de ALA o MAL y el efecto de la PDT con ALA a nivel celular en células THP-1 no infectadas e infectadas con Leishmania ( Viannia ) panamensis o Leishmania ( Leishmania ) infantum (syn. Leishmania chagasi ). Materiales y métodos. La producción de protoporfirina IX y su ‘colocalización´ mitocondrial se evaluaron mediante microscopía ‘confocal´. Se evaluó la toxicidad celular después del tratamiento con los compuestos y la aplicación de irradiación de luz (597-752 nm) en una fluencia de 2,5 J/cm 2 mediante el empleo de la prueba colorimétrica con metil-tiazol-tetrazolio (MTT) en las células, y de métodos microscópicos estándar en los parásitos. Los resultados se expresaron como la concentración del compuesto activo en el 50 % de las células o parásitos (CC 50 o CI 50 ). Resultados. El ácido aminolevulínico o el metil-5-aminolevulinato indujeron la protoporfirina IX endógena en células humanas, y se observó fluorescencia de color rojo en las mitocondrias. La actividad del ácido aminolevulínico y del metil-5-aminolevulinato utilizados con terapia fotodinámica fue similar en las células THP-1 (CC 50 0,16±0,01 mM y 0,33±0,019 mM, respectivamente) y, aparentemente, no inhibió los parásitos en las células infectadas, en comparación con los controles. El tratamiento exógeno con protoporfirina IX y terapia fotodinámica fue tóxico para las células THP-1 (CC 50 0,00032 ±0,00002 mM) y para los promastigotes de L. (L .) infantum (IC 50 0,003±0,0001 mM) y L. ( V .) panamensis (CI 50 0,024±0,0001 mM). Conclusiones. A pesar de la ‘fotoactividad´ del tratamiento con protoporfirina IX en promastigotes y de su producción después del tratamiento con ácido aminolevulínico y metil-5-aminolevulinato en las células infectadas con Leishmania , no se observó daño en los amastigotes presentes en las células de L. ( L .) infantum o L . ( V .) panamensis .

In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi strains from Santander, Colombia, to hexadecylphosphocholine (miltefosine), nifurtimox and benznidazole

Introduction. The current chemotherapy for Chagas disease is unsatisfactory with only two drugs available for treatment. Research to discover new drugs for Chagas disease is urgent. Hexadecyl-phosphocholine (HPC, miltefosine) has been demonstrated to have in vitro activity against Trypanosoma cruzi parasites, but its activity on different Colombian T. cruzi strains is not known. Objective. To evaluate the in vitro susceptibility of T. cruzi strains isolated from humans and vectors in Santander, Colombia, to miltefosine, nifurtimox and benznidazole. Materials and methods. Eight T. cruzi Colombian strains and three reference strains (Esmeraldo, SilvioX10 and Y) were studied. Drug activities against extracellular epimastigotes and intracellular amastigotes were determined by microscopic counting. The results were expressed as the concentrations that inhibited 50% and 90% growth (IC50 and IC90). Results. For miltefosine a similar range of drug activity was observed against all the Colombian strains, all parasites being more susceptible to miltefosine than to the reference drugs. The intracellular amastigotes were more susceptible to miltefosine (IC50 0.08 to 0.63 ìM and IC90 0.21 to 2.21 ìM) than extracellular forms (IC50 <0.92 to 2.29 ìM and IC90 1.38 to 4.76 ìM). For reference drugs, parasites were more susceptible to nifurtimox than to benznidazole and some differences in activity of benznidazole between T. cruzi strains was observed. Conclusions. The results showed the significant in vitro activity of miltefosine against T. cruzi stages, and the expected results for the reference drugs. Further in vivo studies with miltefosine are planned.

Introducción. Los tratamientos actuales para la enfermedad de Chagas son insatisfactorios y sólo existen dos medicamentos disponibles. La búsqueda de alternativas terapéuticas es prioritaria. La hexadecilfosfocolina (miltefosina) ha mostrado actividad in vitro contra Trypanosoma cruzi. Sin embargo, su actividad en aislamientos de T. cruzi obtenidos en Colombia aún no ha sido reportada. Objetivo. Evaluar la susceptibilidad in vitro a miltefosina, nifurtimox y benznidazole de cepas de T. cruzi aisladas de humanos y vectores en Santander, Colombia. Materiales y métodos. Se evaluó la susceptibilidad de los tres medicamentos en ocho cepas colombianas de T. cruzi y tres cepas de referencia: Esmeraldo, Silvio X10 y Y. La actividad de los compuestos fue determinada en epimastigotes extracelulares y amastigotes intracelulares, por conteo microscópico. Los resultados se expresaron en concentraciones inhibitorias 50 y 90 (CI50 y CI90). Resultados. Para la miltefosina, se observaron rangos similares en la actividad del medicamento entre las cepas colombianas; todos los parásitos fueron más susceptibles a la miltefosina que a los medicamentos de referencia. Los amastigotes intracelulares fueron más sensibles a la miltefosina (CI50, 0,08 a 0,63 µM y CI90, 0,21 a 2,21 µM) que las formas extracelulares (CI50, <0,92 a 2,29 µM y CI90, 1,38 a 4,76 µM). En los medicamentos de referencia, los parásitos fueron más susceptibles al nifurtimox que al benznidazole. Se observaron algunas diferencias en la actividad del benznidazole en las cepas estudiadas de T. cruzi. Conclusiones. Los resultados obtenidos de la actividad in vitro de miltefosina y de los medicamentos de referencia contra aislamientos de T. cruzi son satisfactorios y serán considerados en estudios posteriores in vivo.

Efecto fototoxico de la terapia fotodinamica en promastigotes de leishmania amazonensis / Phototoxic effect of photodynamic therapy in promastigotes of Leishmania amazonensis

Introducción: La terapia fotodinámica utiliza un compuesto fotosensibilizador que en presencia de luz y oxígeno produciendo especies reactivas de oxígeno induciendo la muerte de la célula blanco por apoptosis o necrosis. Estudios in vitro han mostrado que la ftalocianina de aluminio es fototóxica para Leishmania spp. Objetivo:El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto del tratamiento con ftalocianina de aluminio clorada en los cambios morfológicos y de la actividad mitocondrial en promastigotes de Leishmania amazonensis. Materiales y métodos: Promastigotes de L amazonensis fueron incubados con ftalocianina de aluminio clorada y posteriormente irradiados con una fluencia de 17 Julios/cm2. De 0, 12 y 24 horas post irradiación los parásitos fueron contados microscópicamente para determinar la inhibición del crecimiento, fueron coloreados con Giemsa para determinar el efecto en los cambios morfológicos y fueron tratados con la sonda fluorescente JC-1 para determinar los cambios en la actividad mitocondrial. Resultados: El tratamiento fotodinámico inhibió el número de promastigotes hasta en un 96,37 %. Se observó reducción del tamaño, fragmentación nuclear y pérdida de núcleo y/o kinetoplasto y pérdida de la actividad mitocondrial. Conclusiones: La terapia fotodinámica es efectiva para la eliminación de promastigotes de L.amazonensis posiblemente por un mecanismo similar a la apoptosis.

Introduction: Photodynamic therapy uses a photosensitizer compound that in presence of light and molecular oxygen is activated producing reactive oxygen species and target cell death by apoptosis or necrosis. In vitro studies have demonstrated the phototoxic effect of aluminium phthalocyanine on Leishmania spp. Objective: The purpose of this study was to determine the effect of chloroaluminum phthalocyanine in the morphological and mitochondrial activity changes of Leishmania amazonensis promastigotes. Materials and methods: Parasites incubated with chloroaluminum phthalocyanine were irradiated with a fluency of 2.5 Julios/cm2. After 0, 12 and 24 hours post irradiation, they were counted microscopically to determine the percentage of inhibition; stained with Giemsa to determine the morphological changes; and treated with the fluorescent probe JC-1 to determine changes in activity mitochondrial. Results: Phothodynamic treatment inhibited the number of promastigotes reaching values of 96.37 %. There was observed downsizing, nuclear fragmentation and loss of nuclear core and / or kinetoplast and loss of mitochondrial activity immediately after irradiation. Conclusions: Photodynamic therapy is effective in eliminating promastigotes of L. amazonensis probably by an apoptosis like mechanism.